1、微笑之谜：500年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。荷兰阿姆斯特丹的一所大学应用“情感识别软件”分析出蒙娜丽莎的微笑包含的内容及比例：高兴83%，厌恶9%，恐惧6%，愤怒2%。
2、蒙娜丽莎：哈佛大学神经科专家玛格丽特·利文斯通博士说，蒙娜丽莎的微笑时隐时现，是与人体视觉系统有关，而不是因为画中人表情神秘莫测。利文斯通博士是视觉神经活动方面的权威，主要研究眼睛与大脑对不同对比和光暗的反应。利文斯通说：“笑容忽隐忽现，是由于观看者改变了眼睛位置。”她表示，人类的眼睛内有两个不同部分接收影像。中央部分（即视网膜上的浅窝）负责分辨颜色、细致印记。环绕浅窝的外围部分则留意黑白﹑动作和阴影。据利文斯通说，当人们看着一张脸时，眼睛多数集中注视对方的双眼。假如人们的中央视觉放在蒙娜丽莎的双眼，较不准确的外围视觉便会落在她的嘴巴上。由于外围视觉并不注重细微之处，无形中突出了颧骨部位的阴影。如此一来，笑容的弧度便显得更加大了。不过，当眼睛直视蒙娜丽莎的嘴巴，中央视觉便不会看到阴影。利文斯通说：“如果看着她的嘴巴，便永远无法捕捉她的笑容。”蒙娜丽莎的笑容若隐若现，源于人们的目光不断转移。利文斯通指出，若要临摹《蒙娜丽莎》，描绘口部时便要望着别处。
3、1993年，加拿大美术史家苏珊·吉鲁公布了一项令人震惊的研究成果。她说蒙娜丽莎那倾倒无数观赏者的口唇，是一个男子裸露的脊背。这一论断既新鲜又荒诞，然而论证是有力的。集画家、雕刻家、建筑师、工程师及科学家等多种才艺于一身的达·芬奇，可谓是个“怪杰”。他喜欢穿粉红色外套，在胡须上毫无顾忌地涂上五颜六色，还常称自己解剖过不下30具死尸。他还是个左撇子，习惯从右到左倒着书写，别人要借助镜子才能读出他写的东西。因此借助镜子亦不失为欣赏者读画的一种方法。旋转90度后从镜中看蒙娜丽莎抿着的笑唇，恰好是一个背部线条分明的结实男性脊背以及左臂和肘部的一角；再说，表现人体美和呼唤人性的觉醒，既是大师的人生哲学，又是他的艺术观。
4、确实，在不同角度不同光线下欣赏这幅画，人们都会得到不同的感受。那微笑时而温文尔雅，时而安详严肃，时而略带哀伤，时而又有几分讽嘲与揶揄，神秘莫测的微笑显露出人物神秘莫测的心灵活动。
5、价值之谜：《蒙娜丽莎》数百年来一直被誉为最名贵的肖像画，60年代估计此画价值已达1亿美元。经过政府允许，从1962年12月14日至1963年3月12日，先后到美国的华盛顿和纽约市展出，轰动了全美国，许多人专程从外地赶来，一睹为快。由于参观的人太多，据说展览会规定每个观众只能在《蒙娜丽莎》画像前面停留3秒钟。以后该画又借到日本展览，轰动的程度更胜于美国，据说每位观众只能看2秒钟。
6、背景之谜：加利福尼亚大学教授卡罗·佩德雷蒂认为，蒙娜丽莎身后的背景是意大利中部阿雷佐市布里阿诺桥附近的景色。佩德雷蒂的证据是，达·芬奇出生在距阿雷佐约100公里的芬奇镇，并曾经在阿雷佐生活过，这一地区的原始景观与《蒙娜丽莎》的背景几乎完全一样，因此，达·芬奇很有可能采用这一地区的田园景色作为《蒙娜丽莎》的背景。当佩德雷蒂的这一观点在达·芬奇绘画国际研讨会上宣布后，许多美术史专家都对他的研究结果表示肯定。
7、原型之谜：500多年来历史学家们一直为达·芬奇名画《蒙娜丽莎》的原型众说纷纭，争论不休。尤其是画中人脸上神秘的微笑是人们猜测的不解之谜。意大利佛罗伦萨市一位普通教师吉乌塞普·帕兰蒂又提出了新的说法，蒙娜丽莎是一位有5个孩子的“家庭主妇”。